SEQUENZIAMENTO DNA

Utilizziamo tecnologie di Next-Generation-Sequencing per analizzare genomi, esomi e pannelli.

Il sequenziamento del DNA comprende l’analisi del genoma, dell’esoma e di pannelli di geni customizzati sulle esigenze del cliente. La nostra consolidata esperienza su una vasta gamma di soluzioni per la preparazione delle librerie ci permette di fornire servizi di sequenziamento consistenti. Siamo titolari di un brevetto che permette di selezionare i protocolli di preparazione delle librerie, in funzione della migliore copertura analitica dei geni identificati dai clienti.

PREPARAZIONE DEL CAMPIONE

ESTRAZIONE
Estrazione degli acidi nucleici è uno dei punti critici per ottenere dati di NGS consistenti e di alta qualità. Noi siamo in grado di selezionare i kit migliori per l’estrazione dalle diverse matrici (es. sangue, plasma, paraffinati, tessuto fresco e saliva).

CONTROLLO QUALITÀ
Nel percorso di sequenziamento applichiamo stringenti protocolli di controllo qualità che ci permettono di informare in tempo reale il cliente sullo stato di avanzamento dell’analisi. I principali strumenti di verifica della qualità e quantità del DNA estratto che utilizziamo sono:, NanoDrop, LabChip e Qubit. Per i campioni paraffinati, siamo in grado di valutare anche l’amplificabilità e il grado di frammentazione del DNA.

SEQUENZIAMENTO

Il tipo di sequenziamento dipende dalla lunghezza della libreria e dalla scelta del kit di cattura. Prevalentemente utilizziamo i sequenziatori Illumina, ma abbiamo anche esperienza di sequenziamento su altre piattaforme, le quali possono essere utilizzate su specifica richiesta del cliente.

ESOMA (WES) E PANNELLI
Scelta del kit di cattura

Valutiamo costantemente le prestazioni delle nuove piattaforme di arricchimento. Questo ci permette di avere una banca dati proprietaria, che può essere interrogata per valutare quale sia il kit più adatto per ogni regione dell’esoma, dalla quale abbiamo ottenuto il sistema di selezione dei kit di cattura e lunghezza dei frammenti presente nel brevetto.

GENOMA COMPLETO (WGS)
Utilizziamo librerie PCR-free per garantire la massima copertura possibile. Le librerie genomiche prodotte con protocolli che prevedono l’utilizzo della PCR, infatti, mostrano una copertura più irregolare o assente, che per noi di Personal Genomics non è sufficiente.

SEQUENZIAMENTO

Il tipo di sequenziamento dipende dalla lunghezza della libreria e dalla scelta del kit di cattura. Prevalentemente utilizziamo i sequenziatori Illumina, ma abbiamo anche esperienza di sequenziamento su altre piattaforme, le quali possono essere utilizzate su specifica richiesta del cliente.

ESOMA (WES) E PANNELLI
Scelta del kit di cattura

Valutiamo costantemente le prestazioni delle nuove piattaforme di arricchimento. Questo ci permette di avere una banca dati proprietaria, che può essere interrogata per valutare quale sia il kit più adatto per ogni regione dell’esoma, dalla quale abbiamo ottenuto il sistema di selezione dei kit di cattura e lunghezza dei frammenti presente nel brevetto.

GENOMA COMPLETO (WGS)
Utilizziamo librerie PCR-free per garantire la massima copertura possibile. Le librerie genomiche prodotte con protocolli che prevedono l’utilizzo della PCR, infatti, mostrano una copertura più irregolare o assente, che per noi di Personal Genomics non è sufficiente.

MIGLIORARE LA GENOTIPIZZABILITÀ
Per ottenere la massima genotipizzabilità, abbiamo sviluppato protocolli di preparazione delle librerie di cattura in grado di modificare la lunghezza dei frammenti. Allungando il frammento a una lunghezza media di circa 300-350bp (contro le 150-200bp previste dai protocolli standard), è possibile sequenziare con protocollo 150PE e, di conseguenza, migliorare la mappabilità delle sequenze e la successiva chiamata delle varianti.

PANEL DESIGN
Le informazioni di copertura e genotipizzabilità dei diversi kit di cattura al variare della lunghezza media del frammento hanno permesso lo sviluppo di un’applicazione, che consente di scegliere la migliore configurazione possibile nel sequenziamento di un pool di geni.
Noi di Personal Genomics abbiamo brevettato il nostro metodo di produzione delle librerie.

ANALISI BIOINFORMATICA

Analisi Bioinformatica di I livello Analisi Bioinformatica di II livello Analisi Bioinformatica di III livello
Demultiplexing
Produzione dei file FastQ
Allineamento
Chiamata delle varianti
Annotazione
Prioritizzazione delle varianti

ALLINEAMENTO E CHIAMATA DELLE VARIANTI

  • Allineamento su reference (hg19 o hg38) e produzione file BAM;
  • Chiamata varianti con pipeline BWA-mem/GATK4 e produzione dei file VCF + regioni genotipizzabili.

Il VCF riporta le informazioni sulle varianti chiamate in un individuo e assume che la mancanza di informazione equivalga alla presenza in omozigosi dell’allele di riferimento.
Tale assunto è falso perché una posizione potrebbe non essere presente nel VCF anche per mancanza di adeguata copertura nel pannello o per bassa mappabilità. Per questo forniamo un file che riporta le regioni genotipizzabili.
In alternativa alla pipeline standard BWA-mem/GATK4, è possibile produrre un file gVCF utilizzando la pipeline iSAACalign/strelka.

ANALISI DI COPERTURA E GENOTIPIZZABILITÀ
NON consideriamo le coperture teoriche, ma soltanto quelle reali, escludendo quindi:

  • Off target
  • Padded Region
  • Duplicati

Noi di Personal Genomics abbiamo sviluppato una pipeline per fornire una dettagliata analisi del coverage e della genotipizzabilità per tutte le regioni codificanti in RefSeq nel caso di un esoma completo o della regione target nel caso di un pannello.

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    Tipologia di analisi richiesta